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光學顯微鏡的主要觀察方法及使用技巧

發布時間:2021-12-15      點擊次數:291
  我們平時用到的正置顯微鏡和倒置顯微鏡,統稱為復合式顯微鏡,可以用來觀察涂片或切片、培養的活細胞、水中的微生物或進行顯微操作等。顯微鏡主機搭配各種光學組件可以實現各種觀察方法:明場、相差、暗場、微分干涉(DIC)、整合調制反差(IMC)等,針對不同的標本,選用適合的觀察方法才能得到的圖像。
  明場觀察
  通常所說的明場,指的是由顯微鏡光源的照明光經過聚光鏡匯聚照射到標本上,被標本吸收后,剩余的光進入物鏡,然后通過目鏡被人眼看到或者被通過C接口被攝像頭拍到。照明光路采用科勒照明或臨界點照明。
  血涂片、革蘭氏染色的細菌涂片、染色的病理切片、植物的切片、骨磨片等都采用明場方式觀察。這幾類標本比較適合用正置顯微鏡觀察,與倒置顯微鏡相比,正置顯微鏡的聚光鏡可以離標本很近,數值孔徑比較大,所以整體的分辨率要比倒置鏡高,看標本更清楚。
  明場觀察的要求主要是結構清晰、顏色準確,如何保證清晰準確呢?
  首先是制片,為了盡可能的看到清晰的結構,我們先注意一下標本制備中要不要封片以及如何封片的問題,因為不同的物鏡對標本封片與否的要求是不一樣的。
  1.光學顯微鏡中物鏡上的重要參數
  對于需要封片的標本,標本要浸沒在封片劑中,再蓋上蓋玻片,不可以不加封片劑直接蓋蓋玻片。封片劑的折射率一般與標本接近,盡量減少成像光路中折射率的突兀變化,以保證通透性。生物組織的折射率一般在1.3~1.5之間,蓋玻片的玻璃折射率為1.52左右,油鏡的油折射率為1.518,所以封片劑的折射率一般不超過1.518。
  2.光學顯微鏡制片
  其次是顯微鏡組件參數,數值孔徑(NA)是物鏡和聚光鏡的固有參數,物鏡的數值孔徑(NA)越大分辨率越高,看到的標本就越清楚。同樣,聚光鏡的數值孔徑越大分辨率越高。所以選擇數值孔徑比較大的物鏡和聚光鏡有助于看清更多的標本細節孔徑光闌(Aperture)位于聚光鏡上,孔徑數值可調,也影響分辨率,孔徑數值越大顯微鏡成像分辨率越高。
  3.孔徑光闌
  注意:物鏡和聚光鏡的數值孔徑越大,其工作距離(或者理解為焦距)越短??讖焦怅@數值越大,顯微鏡成像的對比度越低,景深越小。
  4.另外,照明光源的色溫會影響到顯色效果。同一個標本,照明色溫比較低時,標本中的紅色就比較鮮艷,藍色比較暗;相反色溫偏越高時,標本中藍色就越鮮艷紅色越暗。
  顯微鏡常用作明場照明的光源有兩種:鹵素燈和LED燈。
  鹵素燈的整體色溫比較低,看起來明顯偏黃色,一般會在照明光路里加一個日光濾片提高色溫,使標本的顏色更均衡。然而鹵素燈的色溫會隨著燈的亮度而變化,燈調節的越亮,色溫越高。我們知道在使用顯微鏡從低倍物鏡轉換到高倍物鏡時,需要調亮照明光來保證目鏡觀察到的視野亮度一致,這樣就會導致色溫升高,從而使得高倍鏡看到的標本中藍色結構比低倍鏡中更鮮艷,而低倍鏡中看到的紅色結構更鮮艷。要解決這個色彩偏差,方法有:
  基礎的顯微鏡可以配置恒定亮度的物鏡組,低倍鏡跟高倍鏡的亮度一樣,這樣就不需要調整燈的亮度。
  高級的全自動顯微鏡使用恒定色溫轉輪,根據不同物鏡自動調整鹵素燈亮度并自動調節色溫轉輪,來使最終的照明色溫保持恒定。
  使用恒定色溫的照明光源:LED燈。
  LED燈的色溫恒定,不會隨亮度變化。顯微鏡明場照明用的LED燈通常色溫恒定在5000K,接近太陽光的平均色溫。
  最后使用顯微鏡配備的攝像頭拍照時,如果發現電腦屏幕上呈現的圖像偏色,就需要先做一下白平衡。
  4選取視野中的空白區域作為參照進行白平衡,顏色的鮮艷程度則可以通過色飽和度調節,飽和度越高,圖像色彩越艷麗,飽和度低時,圖像就失去色彩呈現為黑白色。
  需要注意的是,不必要求屏幕上顯示的標本顏色跟目鏡里看到的完全一致,因為任何顯示器所能顯示的顏色都是有限的,
  5.人眼與不同顯示器觀察到的色域不同相差成像檢查培養中的活細胞的生長狀態時,常用相差方法觀察。因為活細胞一般不染色,細胞比較透明,直接用明場觀察的話不容易看清楚,用相差方式可以提高反差,更容易看清細胞狀態。
  6活細胞觀察對比顯微鏡要實現相差效果需要兩個條件:相差物鏡和相差環,觀察時需要選擇相差物鏡并將對應的相差環移入光路。相差物鏡上會有標志“PH0”、“PH1”、“PH2”等,數字表示對應的相差環型號,另外相差環上也會明確標注對應的物鏡倍數,使用相差時一定要保證物鏡和相差環正確匹配。
  7.相差成像設備圖解
  暗場成像
  實際是暗場照明法。不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被物體反射或散射的光線,暗背景,樣品閃亮。適合觀察微小水生生物、纖維、毛發、細菌,以及進行尿檢等。
  8.明暗成像對比
  9.暗場成像下的小水生生物
  暗場觀察所需要的特殊附件是暗場環和聚光鏡,聚光鏡的數值孔徑至少比所用物鏡大0.2才可以實現較好的暗場效果。
  10.暗場成像原理
  微分干涉(DIC)成像如果細胞標記了熒光,就不太適合再用相差物鏡觀察了,因為相差物鏡內有相位環,會阻擋部分熒光,此時比較適合的反差增強方法是DIC。DIC可以用高透光的復消色差物鏡搭配DIC棱鏡和偏光片來實現,拍攝熒光時DIC組件可以從光路中移除,不會對熒光成像產生影響。
  DIC呈現出漂亮的3D圖像(非真實三維圖像),無光暈,分辨率大于相差,適合搭配熒光,但是不適合在塑料器皿中成像。
  DIC下的細胞成像
  DIC成像時需要在光路中移入4個組件,相對比較復雜,所以一般配在全自動顯微鏡上,由顯微鏡自動控制各個組件,以方便使用者操作。并可實現長時間定時拍攝,記錄動態過程。
  整合調制反差(IMC)成像
  顯微操作時,需要標本呈現出一定的立體效果,DIC雖然有立體效果,但是用DIC時不能用塑料器皿,而顯微操作多數都是在塑料器皿里進行的。整合調制反差(IMC)或者霍夫曼反差(HMC)正好滿足這個需求。
  IMC或者HMC是一種斜照明效果,一側的狹縫照明造成陰影,產生立體效果??捎糜谒芰掀髅髢葮吮镜娘@微操作。
  IMC成像適用于顯微操作
  HMC需要專用的物鏡搭配聚光鏡上的調制器,專用物鏡對熒光有一定的阻擋。IMC無需專用物鏡,可用普通物鏡搭配調制器實現,對熒光成像沒有影響。
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